Идентификация по электрофоретической подвижности

Справочник по основным операциям > Капиллярный электрофорез > Идентификация по электрофоретической подвижности

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

В программе МультиХром предусмотрена возможность определения электрофоретической подвижности (далее – подвижности) компонентов и использования этой величины для идентифи­кации компонентов. Такой способ идентификации применим только в случае неизменности подвиж­ности компонентов для всех электрофореграмм и постоянства подвижности электроосмотического потока (ЭОП)  в течение одной электрофореграммы – например, он не может применяться при разных температурных условиях или при изменении давления по ходу эксперимента.

Время выхода компонента tn связано с подвижностью компонента mn следующим соотношением:

где Le и Lf – эффективная и полная длина капилляра соответственно, U – напряжение, приложенное к капилляру, m0 – подвижность ЭОП.

Чтобы определить калибровочные значения подвижности компонентов, которые хранятся в Таб­лице компонентов и далее используются при идентификации, необходимо получить электро­фореграмму смеси, в которой присутствует нейтральный компонент-маркер ЭОП. Подвижность ЭОП принимается равной подвижности маркера и определяется по формуле:

, где tM – время удерживания маркера. Калибровочные значения подвижности компонентов mCn рассчитываются по формуле:

.

Чтобы проводить идентификацию компонентов на основе значений подвижности, требуется выбрать среди них хотя бы один реперный компонент, пик которого будет легко идентифицироваться на любой электрофореграмме - например, как самый большой пик на достаточно широком участке электрофореграммы. Подвижность ЭОП в случае одного репера для каждой электрофореграммы рассчитывается по формуле:

, где tR – измеренное время удерживания репера, mR – калибровочное значение подвижности ре­пера. В случае нескольких реперов берется среднее значение. Определенная таким образом вели­чина m0 используется для расчета ожидаемого времени удерживания компонентов tСn с использо­ванием значений их подвижности mСn из Таблицы компонентов:

Идентификация проводится путем сравнения tСn с измеренными в данной электрофореграмме вре­менами удерживания tn. Сравнение производится по времени удерживания, а не по подвижности, так как именно для удерживания задаются границы окна, в пределах которого производится поиск. Значения подвижности mn, которые рассчитываются по измеренным временам удерживания tn, приводятся в отчете как дополнительная информация.

Для перехода к идентификации компонентов по подвижности выполните следующее.

•Получите образцовую электрофореграмму смеси, содержащей все определяемые компоненты. Если в их числе нет нейтрального компонента, который может служить маркером ЭОП, такой компонент необходимо добавить специально.

AДля расчета подвижностей необходимо, чтобы были заполнены поля Эффективная длина и Полная длина на листе Паспорт/Капилляр и Высокое напряжение на листе Паспорт/Электрофорез!

•Создайте Таблицу компонентов (см. раздел Создание Таблицы компонентов).

ы

•Откройте окно Идентификация компонентов, нажав кнопку Идентификация.

•Выберите 1-3 компонента, которые будут в дальнейшем использоваться в качестве реперов, то есть, компонентов, которые будут определяться по какому-либо обычному хроматографическому параметру (высота, площадь, номер пика). ( См. также раздел Количественный и качественный анализ/Анализ пробы неизвестного состава/ Идентификация компонентов/) В качестве реперов следует выбирать компоненты, которые будут присутствовать в любой электрофореграмме. Определите, по какому признаку будут идентифицироваться реперы.

oЕсли идентификация реперов будет производиться по высоте, в области Схема установите переключатель Стандартная КЭФ.

oЕсли идентификация реперов будет производиться по другому признаку, в области Схема уста­новите переключатель Заказная, а в области Параметры идентификации в списочном поле Реперные пики выберите требуемый параметр, в поле Другие пики – параметр Подвижность.

•В списочном поле Маркер ЭОП выберите компонент-маркер.

•Закройте окно, нажав кнопку ОК. При этом будет произведен расчет калибровочных значений подвижности для всех компонентов.

AПри измерении калибровочных значений подвижности в Таблице компонентов ни должно быть ни одного отмеченного репера!

•Для просмотра полученных результатов выполните следующее.

oОткройте окно Опции отчета, нажав кнопку .

oВ списочном поле Шаблон выберите файл capel.rtt.

oВ области Куда направить отчет установите флажок Экран.

oНажмите кнопку Отчет. В открывшемся окне отчета под Таблицей пиков добавится раздел с результатами расчета подвижностей.

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ПОДВИЖНОСТЬ КОМПОНЕНТОВ

Подвижность ЭОП  18.1109*10^6 см^2/(B*c)

Маркер ЭОП   стронций

No Удерживание Удерживание Подвижность Подвижность Имя

   с ожидаемое,с  *10^6 Калибр.*10^6

1  462.7  462.7  14.31   14.31 цезий

2  491.9  491.9  12.38   12.38 аммоний

3  534.2  534.2  9.969   9.969 калий

4  661.9  661.9  4.55    4.55 натрий

5  766.7  766.7  1.453   1.453 магний

6  794.7  794.7  0.7631  0.7631 литий

7  828.2  828.2  0       0 стронций

8  872.4  872.4  -0.9168  -0.9168 барий

9  897.4  897.4  -1.396   -1.396 кальций

Таблица содержит столбцы No (номер пика n), Удерживание (измеренные значения tn), Удерживание ожидаемое (ожидаемые значения tСn), Подвижность (значения mn , определенные для данной электрофореграммы), Подвижность калибр. (калибровочные значения mСn), Имя (имя компонента). Удерживание измеряется в единицах, заданных в поле Единицы удерживания окна Идентификация компонентов, подвижность – в (см2/В•с)•106 .

В случае электрофореграммы, по которой производится измерение калибровочных значений подвижности, в столбцах Удерживание и Удерживание ожидаемое, а также Подвижность и Подвижность калибр. стоят одни и те же величины, кроме того, для компонента-маркера значения подвижности равны 0.

oЗакройте окно отчета.

•В Таблице компонентов для выбранных реперов в столбце Репер установите значения Да и увеличьте, насколько возможно, величину параметра в столбце Окно.

•Если маркер не входит в число определяемых компонентов и присутствие его в Таблице пиков в отчете не желательно, удалите соответствующую строку из Таблицы компонентов.

•Просмотрите полученные результаты в отчете. Оцените правильность выполняемой идентификации компонентов. При неудовлетворительном результате произведите дополнительную настройку процедуры идентификации: выберите другие реперы и/или измените схему распознавания.

Подвижность ЭОП  18.2543*10^6 см^2/(B*c)

Маркер ЭОП  

No Удерживание Удерживание Подвижность Подвижность Имя

   с ожидаемое,с  *10^6 Калибр.*10^6

1  454.4  460.6  14.76  14.31 цезий

2  480.2  489.6  12.98  12.38 аммоний

3  524.8  531.5  10.33  9.969 калий

4  650.7  657.8  4.797   4.55 натрий

5  763.5  761.1  1.393  1.453 магний

6  788.6  788.8  0.7663  0.7631 литий

7  870.6  865.2  -1.025  -0.9168 барий

8   903  889.8  -1.643  -1.396 кальций

•Закройте Таблицу компонентов, нажав кнопку ОК.

•Сохраните метод, выбрав команду Файл/Сохранить/Метод.

•Получите с помощью созданного метода несколько электрофореграмм и, при необходимости, проведите дополнительную коррекцию процедуры идентификации.