Содержание- Спектральные операции - Теория спектральных операций
Что такое спектр
.
В аналитической химии под спектрами понимают спектры поглощения или испускания исследуемых образцов в УФ-, видимом и ИК диапазонах.
Классическим примером спектра является УФ-спектр поглощения раствора какого-либо вещества.
Спектры по своей физической природе являются непрерывными, но в результате обработки с использованием цифровой техники обычно преобразуются в набор измерений, сделанных с некоторым постоянным шагом изменения длины волны.
Шаг длины волны выбирается в зависимости от оптического разрешения спектрометра и структурности спектра. Нет смысла хранить более детализированный спектр, чем разрешение прибора или тонкая структура самого спектра.
В хроматографии используются спектральные детекторы 2 типов – сканирующие и диодно-матричные. Сканирующий детектор получает весь спектр за некоторый промежуток времени, длительность которого при большом числе точек может оказаться сопоставимой с шириной хроматографического пика, при этом получаемый спектр соответствует образцу непостоянного состава. Для исключения влияния изменения состава спектральные измерения производят в режиме остановки потока. При малом числе спектральных точек и, как следствии, малом изменением состава за время сканирования, может вносится расчетная поправка, приводящая измеренные значения к одному моменту времени.
Диодно-матричные детекторы позволяют получать истинный мгновенный спектр образца. Например, Bischoff DAD100 diode array детектор может измерять мгновенный УФ-спектр поглощения с частотой около 10 Гц в диапазоне 190-390 нм с шагом длины волны 2 нм без остановки потока.
Спектральная хроматограмма представляет собой многоканальную хроматограмму с числом каналов, равным числу значений длины волны, на которых производится измерение оптического сигнала. Каждой временной точке хроматограммы соответствует мгновенный спектр, содержащий число спектральных точек, равное числу каналов. Так, в случае DAD100 детектора каждый мгновенный спектр состоит из 101 точки данных.
В общем случае спектр может состоять из измерений, сделанных с непостоянным шагом длины волны. Более того, совокупности сигналов, полученных по разным каналам от детекторов, измеряющих сигналы различной физической природы, могут также трактоваться как спектры.
Также возможно рассчитать средний спектр пика или спектр в некоторых особых точках пика (спектр в вершине, спектр наилучшей чистоты).
Абсолютное значение сигнала детектора сохраняется в хроматограмме. В хроматографической практике часто применяется измерение величины сигнала детектора относительно базовой линии (назовем эту величину откликом детектора).
Замечание: все спектры в программе МультиХром считаются спектрами ответов детектора
В отличие от 3D вида хроматограмм, предлагаемого многими программами обработки данных фотодиодных детекторов, МультиХром использует другой подход к обработке многоканальных хроматограмм.
Хроматограмма рассматривается как кривая в многомерном пространстве, где каждая координата представляет отклик детектора на определенной длине волны, а временнОй координате соответствует порядковый номер точки.
Одна точка в пространстве откликов детектора (DR) представляет один спектр.
Если вычесть базовую линию в такой хроматограмме, то хроматографическая кривая группируется вокруг нуля и пики выглядят как фрагменты кривой, начинающиеся из нуля и возвращающаяся снова к нулю. Однако, анализ кривой в DR-пространстве не вполне подходит, и основная причина этого то, что метод спектрального анализа основан на методе наименьших квадратов. Метод наименьших квадратов может быть использован только если ожидаемые погрешности сравнимы для всех координатных осей, иначе результаты будут искажены.
Естественный путь получения единого пространства координат, которое подходит для всех типов спектрального анализа - это использование единиц измерения равных шуму (или ожидаемой погрешности измерения) для каждой оси. В данном случае каждая ось координат представляет отношение сигнал/шум (S/N) для одного канала. Эта модифицированная система координат называется пространством отношений сигнал/шум (NNDR). Точка в пространстве NNDR представляет нормализованный спектр. NNDR и DR пространства могут преобразовываться друг в друга линейной трансформацией.
D = R*W (1)
где D = нормализованный спектр из NNDR пространства (вектор отношений сигнал/шум);
W = весовая матрица с wij =0 (i ≠ j) и wii = 1/Ei, где Ei - ожидаемая ошибка для канала i;
R = (R1,...,RN) = вектор откликов детектора, и
N = число каналов (длин волн).
Замечание: NNDR пространство может использоваться для анализа физически различных сигналов, т.е. абсорбции, проводимости, радиоактивности, одинаковым образом с помощью одних и тех же многоканальных хроматограмм.
Сравнение спектров
Наиболее важную дополнительную информацию из многоканальной хроматограммы можно извлечь путем сравнения спектров.
Например, чтобы установить гомогенность хроматографического пика, нужно сравнить все исходные спектры пика; спектральная идентификация основана на сравнении спектра пика с библиотекой спектров; и т.д.
Следовательно, очень важен правильный выбор критерия для сравнения спектров.
Существует много способов сравнить спектры. Из них наиболее широко распространены следующие:
•сравнение спектральных отношений;
•сравнение, основанное на коэффициентах корреляции;
•сравнение, основанное на величине угла между спектрами.
Ниже приведен пример двух простейших спектров (1 and 2), полученных на двух длинах волн. Для иллюстрации основных способов сравнения спектров можно использовать два таких простейших спектра.
Рисунок представляет плоскость, образованную двумя осями, каждая из которых отражает оптическую плотность на определенной длине волны, допустим 260 и 280 нм. Затем двухволновой спектр отмечается как точка на плоскости. Очевидно, что каждая точка на плоскости задает вектор. Вообще говоря, каждый спектр представлен вектором в многомерном пространстве длин волн, поэтому концепция вектора эквивалентна спектру.
Замечание: каждый спектр может быть представлен вектором в NNDR пространстве.
Спектральное отношение - это отношение отклика детектора на одной длине волны к отклику на другой (базовой) длине волны. Ясно, что, если оба отклика внутри линейного диапазона детектора, такое отношение не будет зависеть от концентрации компонента, и индивидуально для каждого вещества. Для вычисления спектрального отношения необходимо знать отклики детектора на каждой длине волны. Однако для нескольких длин волн возрастание количества возможных спектральных отношений стремительно растет, и, например, для спектра, измеренного на 8 длинах волн существует 28 спектральных отношений, а для 100 длин волн число спектральных отношений будет 4950!
Коэффициент корреляции двух векторов (т.е. двух спектров) равняется косинусу угла между ними, и поэтому угол и коэффициент корреляции однозначно связаны друг с другом. Однако, коэффициент корреляции является гораздо худшей мерой сравнения спектров, чем угол.
Угол между векторами спектров может использоваться как мера их различия, и в большинстве случаев использование его предпочтительно. Угол в отличие от коэффициента корреляции является расстоянием в строгом математическом смысле, так как для него выполняется неравенство треугольника (для любых трех точек A, B, и C расстояние |AC| не больше чем сумма расстояний |AB| + |BC|). В отличие от спектральных отношений, угол является интегральной характеристикой разницы спектров, так как любая пара спектров характеризуется углом между ними, независимо от числа длин волн. Однако, оценить значимость разницы углов не просто.
Нормализация спектральных осей
Рассмотрим другую упрощенную модель. Допустим, что анализируемый компонент содержит изотоп радиоактивного элемента, и элюент измеряется двумя детекторами:
1) УФ-детектор с длиной волны 280 нм и
2) детектором радиоактивности (счеты в секунду).
Плоскость с указанными осями показан на рис. 3. Точки на плоскости также возможно назвать спектрами, однако, единицы на осях различны. В таком пространстве невозможно подсчитать угол между векторами или длину вектора: угол зависит от шкалы осей, а векторная длина получается сложением квадрата оптических единиц с квадратом счета в секунду и вычитанием квадратного корня из этой химеры.
В случае спектров с унифицированными координатами (например, УФ-спектров) эти проблемы остаются, так как погрешности измерения на различных длинах волн могут сильно отличаться, и сравнение спектров с учетом ошибки измерения дадут более правильные результаты.
Таким образом, в программе использована процедура нормализации осей: вместо отклика детектора используется отношение отклика к некоторой средней ошибке измерения. В этом случае единицы осей координат становятся одинаковыми, и угол между спектрами снова может использоваться для их сравнения. Таким образом, спектры переводятся в некоторое нормализованное спектральное пространство, где отклик детектора на каждом канале нормализован на ошибку измерения (т.е. используется Error-Normalized Detector Response (ENDR) ).
Спектральная гомогенность пика.
Спектральная информация, содержащаяся в многоканальной хроматограмме может использоваться для проверки гомогенности хроматографического пика.
Тем не менее, для различения компонентов внутри пика необходимо два дополнительных условия:
1) все компоненты должны иметь различные спектры
2) все компоненты должны иметь хотя бы малейшее различие времен удерживания.
Во время проверки гомогенности хроматографического пика происходит сравнение огромного числа спектров внутри хроматографического пика. Проверяется предположение: все спектры принадлежат одному веществу. Если это так, то все спектральные вектора этого пика, подчиняясь закону Ламберта-Бера, должны лежать с точностью до ошибки измерения вдоль одной прямой. Это предположение проверяется в рамках многомерного регрессионного анализа, путем выявления наилучшей прямой по экспериментальным точкам.
Метод главных компонентов позволяет вычислить:
•направление вектора спектра;
•средние величины отклонений;
•количество индивидуальных спектральных компонентов в пике.
Закон Ламберта-Бера постулирует линейную зависимость между концентрацией вещества и оптической плотностью.
где
T трансмиссия, определяемая как частное от деления интенсивности пропущенного света на интенсивность падающего,
ε коэффициент экстинкции, являющийся характеристикой анализируемого вещества для заданной длины волны,
c концентрация аналита,
d длина оптического пути кюветы, используемой для измерения
Анализ гомогенности пика
Спектральная гомогенность пика является необходимым критерием его чистоты: если спектральная гомогенность нарушена, то присутствуют примеси.
Для гомогенного пика все его мгновенные спектры могут быть получены умножением спектра компонента на мгновенную концентрацию компонента. В этом случае 100% сигналов будут получены из единственного собственного вектора, и этот вектор будет спектром компонента. На практике все не совсем так.
Ошибка измерения определяет погрешность спектров. Для диодного детектора шум не должен превышать 1%, если отклик детектора около 1AU. Это значение было принято как пороговая величина для значимости отличия спектров.
D = c * Q + e
где D вектор отклика детектора,
c концентрация компонента,
Q спектр компонента приведенный к пространству NNDR ,
e – вектор ошибки.
Лимит значения в 1% может быть адекватным только в предварительном анализе пика. Действительное значение должно быть определено экспериментально, путем проведения хроматографического анализа индивидуального компонента используя те же хроматографические условия и приблизительно ту же концентрацию, что и в рабочем анализе. Реальное значение порога будет дано спектральным анализом этого изначально гомогенного пика, и будет равно значению второго по величине собственного вектора.
Негомогенные хроматографические пики характеризуются несколькими значимыми собственными числами в таблице спектральных компонентов:
Число значимых собственных чисел матрицы называются ее рангом.
В случае, когда спектры всех веществ, составляющих перекрывающиеся пики, известны заранее, можно использовать метод наименьших квадратов, раскладывая спектр смеси по базису известных спектров компонентов. В случае известных спектров, уравнение 3 представляет ряд из N уравнений с K неизвестными, где K - это число индивидуальных компонентов и N, как и раньше, - число каналов (длин волн). В случае, когда K<N, мы можем применить метод наименьших квадратов, который даст решение вышестоящего уравнения в форме:
где C = (c1, c2, ..., ck) вектор концентрации,
D = вектор детектора, и
Q = (N*K) матрица составленная из K векторов, полученных из чистых спектров компонентов.
Конечно, спектры чистых компонентов должны быть линейно независимы (не очень похожи), иначе инверсия матрицы в уравнении 4 не может быть произведена. Если эти условия выполнены, разложение возможно и дает уникальный вектор концентрации C. Производя спектральное разложение для каждой точки пика, мы можем получить профиль концентрации для каждого компонента.
Анализ многоканальной хроматограммы также возможен без предварительных знаний спектров компонентов. В этом случае применяются методы многомерного анализа, то есть метод основных компонентов и факторный анализ. Теория и детальное описание алгоритмов для этих методов здесь не обсуждаются.
Обзор реализованного в программе МультХром метода факторного анализа представлен ниже.
Процедура факторного анализа происходит следующим образом:
а) С помощью метода главных компонентов создается подпространство с минимальным числом измерений, которое содержит всю кривую пика с допустимой ошибкой. Размерность подпространства представляет количество компонентов в пике, и спектры компонентов являются линейной комбинацией базовых векторов подпространства.
б) Отфильтровывается шум путем помещения всей кривой пика в подпространство главных компонент.
в) Среди всех точек пика выбираются лучшие кандидаты роль "чистого спектра" для каждого компонента. Делается допущение, что внутри пика первого компонента существует некоторая точка, где он не содержит примесей, и предполагается, что спектр в этой точке является действительно спектром первого «чистого» компонента, и т.д.
г) Строятся профили элюирования каждого компонента в пике и вычисляются их количества.
При проведении факторного анализа пика надо помнить о сделанных допущениях: (а) элюированные вещества имеют линейно независимые (различные) спектры, и (б) профили элюции сдвинуты в отношении друг друга, так что для каждого компонента есть точка внутри анализируемого фрагмента хроматограммы, в которой присутствует только этот компонент.
Признаки явной негомогенности пика
В некоторых случаях может быть дано неверное заключение о негомогенности пика или фрагмента.
Возможны следующие случаи.
•Ошибки вычитания базовой линии наиболее типичны в случае перекрывающихся пиков и неправильного выбора параметров разметки на пики. Эти ошибки могут быть выявлены при визуальном анализе хроматограммы. Базовая линия может быть поправлена пользователем, как написано в руководстве программы. Автоматическую (или ручную) разметку на пики рекомендуется проводить, используя канал "total S/N".
•Разновременность измерений на разных каналах. Приведение измерений к одному моменту времени (синхронизация) применимо для быстрых сканирующих детекторов или нескольких детекторов, соединенных последовательно. Чем выше частота регистрации, тем меньше ошибка синхронизации. Следует стремиться к тому, чтобы самый узкий пик был описан не менее чем 30 точками данных. В случае с несколькими последовательными детекторами дополнительное уширение и смещение пика может быть получено вследствие влияния соединительных линий детекторов. Для детекторов на линейке диодов такие ошибки можно игнорировать.
•Сигнал детектора вышел за пределы динамического диапазона. Сигнал для больших пиков может зашкаливать. И АЦП и детектор имеют гарантированный линейный динамический диапазон, где ошибка измерения не превышает некий пороговый уровень. Каналы с сигналом, превосходящим этот порог будут проигнорированы во время процедуры спектрального анализа. Конечно, точность факторного анализа будет понижена по сравнению с незашкаленной хроматограммой.
Обратите внимание, что линейный диапазон детектора на некоторых каналах может быть значительно ниже, чем по спецификации прибора из-за абсорбции элюента.
•Для узких пиков может наблюдаться градиент концентрации в кювете спектрофотометра. Этот эффект можно минимизировать оптимизацией динамических свойств кюветы детектора (в идеальном случае динамический объем кюветы равен ее геометрическому объему.
• При высокой концентрации компонента в элюате может наблюдаться рефрактометрический эффект. Этот эффект также может быть минимизирован правильной геометрией кюветы. Вдобавок, высокая концентрация компонента в кювете может вызывать нарушение закона Букера.
• Флюоресценция компонента также может приводить к нелинейности отклика детектора (нарушение закона Букера).
Перечисленные эффекты ведут к ошибочному разделению гомогенного хроматографического пика на два или более пиков с очень похожими спектрами и с формами, которые значительно отличаются от гауссианы, характерной для хроматографических пиков.